5/29/2020
Ilmu mikrobiologi mempelajari seluk-beluk kehidupan makhluk hidup tak kasat mata yang disebut mikroorganisme. Mikroorganisme ada banyak jenisnya, seperti bakteri, amoeba, virus, jamur, protozoa dll. Dengan mempelajari mikroorganisme akan memudahkan dalam mengetahui sifat-sifat, manfaat dan dampak negatif yang ditimbukan.
Pertama kali yang dilakukan saat mempelajari mikroorganisme adalah dengan mengamati bentuk morfologinya, contohnya adalah morfologi bakteri. Sel bakteri secara alami mempunyai morfologi dan sifat-sifat khas yang menarik untuk dipelajari. Dinding sel bakteri mempunyai warna jernih atau transparan dan hampir sama dengan warna air dilingkungannya. Sehingga apabila diamati dibawah mikroskop cahaya akan sulit dikenali dan dibedakan.
Cara yang paling mudah agar bakeri dapat diamati dengan jelas adalah dengan melakukan pewarnaan sel / staining. Pewarnaan sel bakteri dilakukan menggunakan zat warna khusus dari bahan kimia yang mampu mewarnai dinding sel dan bagian-bagiannya. Pewarnaan ini akan meningkatkan nilai kontras antara sel bakteri dengan lingkungan sehingga akan mudah untuk diamati. Dalam praktiknya pewarnaan sel bakteri mempunyai beberapa keuntungan diantaranya adalah:
- Memudahkan mengamati penampakan morfologi bakteri secara jelas meliputi bentuk dan ukuran sel. Sel bakteri yang berwarna kontras akan menampilkan bentuk sel yang khas seperti bentuk basil / batang, kokus / bulat, spiral, spiroseta, filamen, oval dll.
- Memudahkan mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel bakteri, seperti ada tidaknya rambut halus / fili, ekor cambuk / flagella, endospora dll.
- Memudahkan dalam mengetahui jenis bakteri melalui sifat-sifat dinding sel. Contohnya bakteri berjenis Gram positif [+], Gram negatif [-], bakteri tahan asam dll.
Secara umum terdapat 4 teknik dasar dalam melakukan pewarnaan sel bakteri, berdasarkan jenis zat warna yang digunakan dan tujuan melakukan pewarnaan. Ke-4 teknik dasar tersebut terbagi menjadi pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan negatif dan pewarnaan struktural. Lebih lengkapnya dijelaskan melalui poin-poin dibawah ini:
Sesuai dengan penamaannya, pewarnaan sederhana hanya menggunakan pewarna tunggal / satu jenis warna untuk mewarnai dinding sel bakteri. Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan sederhana biasanya bersifat basa / alkalin. Sifat basa memiliki muatan positif [+] dan akan mudah bereaksi / berikatan dengan dinding sel bakteri yang bermuatan negatif [-]. Jenis zat warna yang biasa digunakan dalam melakukan pewarnaan sederhana adalah Methylene Blue, Crystal Violet dan Carbol Fuchsin. Tujuan dari melakukan pewarnaan sederhana adalah untuk menggambarkan secara jelas bentuk sel bakteri.
Pewarnaan diferensial atau pewarnaan pembeda digunakan untuk membedakan antar sel bakteri atau bagian-bagian lainnya. Zat warna yang digunakan biasanya lebih dari satu jenis dengan sifat warna yang berbeda. Reagen-reagen khusus juga digunakan untuk mendukung proses pewarnaan. Berdasarkan tujuan penggunaannya, pewarnaan diferensial dibedakan menjadi pewarnaan Gram, pewarnaan Bakteri Tahan Asam, dan pewarnaan Spora Bakteri.
Pewarnaan Gram merupakan suatu teknik pewarnaan untuk membedakan jenis bakteri berdasarkan sifat kimiawi dan fisik dinding sel yang berupa peptidoglikan. Perbedaan struktur peptidoglikan pada dinding sel bakteri akan memberikan perbedaan warna. Perbedaan ini akan mengklasifikasikan bakteri menjadi 2 kelompok utama, yaitu kelompok bakteri Gram positif [+] dan Gram negatif [-].
Zat warna utama yang digunakan pada pewarnaan Gram ada 2 jenis yaitu Crystal Violet dan Safranin. Crystal Violet akan memberi warna ungu dan safranin akan memberi warna merah. Ketika diaplikasikan bakteri Gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah.
Metode pewarnaan ini ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang ahli mikrobiologi Denmark yang bernama Hans Christian Gram untuk membedakan bakteri Pneumococcus dan Klebsiella pneumoniae. Sehingga nama Gram diabadikan menjadi nama teknik pewarnaan ini.
Pewarnaan Bakteri Tahan Asam dikembangkan untuk membedakan 2 tipe bakteri Gram positif berdasarkan ada tidaknya struktur asam mikolat dalam dinding sel. Zat warna utama yang digunakan adalah Carbolfuchsin yang bersifat asam. Carbolfuchsin melalui pemanasan akan diserap oleh struktur asam mikolat, dan akan sangat sulit untuk dilunturkan walaupun menggunakan peluntur kuat seperti asam-alkohol. Sehingga teknik ini dinamakan pewarnaan Bakteri Tahan Asam.
Ada 2 perbedaan metode teknik pewarnaan bakteri tahan asam yaitu yang teknik Ziehl-Neelsen dan teknik Kinyoun. Teknik yang sering digunakan adalah Ziehl-Neelson, yang sering digunakan untuk mengkarakterisasi bakteri Mycobacterium tuberculosis penyebab tuberkulosis / TBC.
Endospora adalah bagian struktur pada dinding sel bakteri yang terbentuk pada saat sporulasi. Sporulasi endospora terjadi ketika bakteri berada pada kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Endospora akan melindungi bakteri dari panas yang tinggi, zat kimia berbahaya dan radiasi agar tetap bertahan hidup.
Endospora hanya dimiliki oleh spesies bakteri tertentu, contohnya Bacillus dan Clostridium. Endospora dapat dideteksi menggunakan teknik pewarnaan Endospora. Metode pewarnaan endospora ada beberapa macam, namun yang sering digunakan adalah metode Schaeffer-Fulton. Zat warna utama yang digunakan adalah Malachite Green [hijau] yang mampu terpenetrasi kedalam struktur endospora bakteri dan mewarnainya. Zat warna sekunder berupa safranin [merah] juga digunakan untuk memberi warna pembanding pada struktur dinding sel yang tidak membentuk endospora.
Pewarnaan negatif hanya menggunakan 1 jenis pewarna untuk mewarnai latar / lingkungan sel. Bukan untuk mewarnai sel secara langsung. Jadi sel akan tampak bening transparan dengan latar / lingkungan yang tampak gelap. Hal ini karena zat pewarna yang digunakan bersifat asam sehingga tidak dapat berikatan dan mewarnai dinding sel bakteri. Teknik ini biasanya digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dan ukuran sel. Contoh zat pewarna negatif yang sering digunakan adalah Eosin dan Nigrosin atau disebut juga tinta India.
Pewarnaan struktural adalah suatu teknik khusus untuk mewarnai bagian-bagian tertentu dari sel bakteri. Contoh pewarnaan struktural adalan pewarnaan flagella bakteri dan kapsul bakteri.
Flagella atau buku cambuk adalah alat gerak yang dimiliki oleh beberapa spesies bakteri. Untuk mengamati flagella diperlukan zat pewarna khusus, karena flagella mempunyai ukuran yang sangat tipis untuk diamati secara langsung dengan mikroskop.
Pertama struktur flagella dipertebal dengan zat Mordan seperti Tannic Acid atau juga dapat menggunakan Potassium alum. Kemudian flagella diberi warna menggunakan Pararosaniline atau pewarna Fuchsin dasar.
Kapsul adalah suatu struktur yang melindungi sebagian bakteri dan yeast. Kapsul juga dapat menjadi indikasi tingkat virulensi suatu bakteri dalam melakukan diagnostik suatu penyakit. Untuk mengamati kapsul pada bakteri diperlukan teknik pewarnaan kusus kapasul. Kapsul sebenarnya tidak dapat menyerap zat pewarna yang diberikan.
Pewarnaan dilakukan pada latar / lingkungan sel atau seperti pewarnaan negatif. Bedanya dalam pewarnaan kapsul bakteri tidak perlu dilakuakn fiksasi pemanasan untuk membunuh bakteri. Zat pewarna yang digunakan dalam teknik juga sama yaitu Nigrosin atau tinta India.
- Dwidjoseputro. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
- Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H and Stahl, D.A. 2015. Brock Biology of Microorganism 14 th edition. Pearson Education, US.
- Pelczar, M.J dan Chan, E.C.S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta.
Tujuan : mengamati bentuk dan warna bakteri menggunakan pewarnaan bakteri tahan asam
Prinsip pemeriksaan : sampel [dahak] dibuat preparat dan diwarnai dengan pewarnaan Ziehl Nelson dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran100 X dengan imersi oil
Dasar Teori Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam [BTA] karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan [Pelczar dan Chan, 1988].
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA [Acid-Fast Stain]. Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan asam [Ball, 1997].
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, ketika Mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida [Thomas, 1999].
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat [2-8 minggu], suhu optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik [middlebrook 7H10 dan 7H11], media telur inspisasi [Lowenstein-jensen], media kaldu [broth media] [Jawetz et al., 2001].
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya [Fardiaz, 1992].
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun Gabbet, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum [sekret paru-paru atau ludah] untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum:
- Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.
- Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.
- Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam
Alat :
- ose bulat / lidi
- Bunsen
- Objek glass
- Deck glass
- Mikroskop
- Pipet tetes
- Rak pewarnaan
Bahan :
- Larutan Zhiehl Neelsen
- sputum / Dahak
- Ambil objek glass yang bersih dan bebas lemak
- Pilih bagian dahak yang kental, warna kuning kehijauan ada perkejuan, ada darah. Ambil sedikit bagian tersebut dengan menggunakan ose / lidi.
- Ratakan diatas objek dengan ukuran 2-3 cm. Apusan dahak jangan terlalu tebal, atau terlalu tipis. Keringkan pada suhu kamar.
- Fiksasi dengan cara melakukan diatas api bunsen dengan cepat sebanyak 3X selama 3-5 detik.
- Letakkan sediaan diatas rak pewarnaan, kemudian tuang larutan Carbool fuchsin sampai menutupi seluruh sediaan.
- Panasi sediaan secara hati – hati diatas api selama 3 menit sampai keluar uap, tetapi jangan sampai mendidih. Biarkan selama 5 menit.
- Cuci dengan air mengalir.
- Tuang HCl alkohol 3 % sampai warna merah dari fuchsin hilang. Tunggu 2 menit.
- Cuci dengan air mengalir.
- Tuangkan larutan methylen blue 0,1 % dan tunggu 10-20 detik
- Cuci dengan air mengalir
- Keringkan
- Amati dibawah mikroskop pembesaran 100 X dengan imersi oil
- Carilah basi tahan asam yang olh pengecetan berwarna merah, berbentuk batang dengan dasar berwarna biru.
BTA positif apabila didalam pengamatan ditemukan BTA, disesuaikan dengan penilaian menurut cara IUAT [ International Union Agains Tuberculosis] :
- Dijumpai 1 – 9 basil tahan asam / 100 lapang pandang = ditulis jumlah yang ditemukan
- Dijumpai 10 – 99 basil tahan asam / 100 lapangan pandang = +
- Dijumpai 1 – 10 basil tahan asam / 1 lapang pandang = ++
- Dijumpai lebih dari 10 basil tahan asan / 1 lapang pandang = +++
BTA Negatif apabila dalam 100 lapangan pandang atau 15 menit pengamatan tidak ditemukan BTA.
| Sumber :ucsfbenioffchildrens.or |
Hasil pengamatan : bentuk, warna, susunan sel bakteri.
A. Makroskopis :
Sampel : sputum
Warna : kuning kental dan memiliki sedikit darah
B. Mikroskopis :
Tidak ditemukan BTA dalam 100x lapangan pandang selama 15 menit.
Tujuan dari pewarnaan BTA pada praktikum ini adalah untuk menentukan BTA dan mengdiagnosa penyskit TBC. Apabila ditemukan BTA maka bakteri tersebut berwarna merah dengan latar biru dan jga dengan jumlah tertentu.
Zat warna digunkan adalah karbon fuchsin untuk memberi warna merah pada bakteri yang tidak luntur oleh zat peluntur [ asam alkohol ] methylen blue untuk pemberi warna latar agar BTA terlihat jelas.
Dari hasil pengamatan, tidak ditemukan BTA. Hal tersebut disebabkan oleh reagen yang rusak atau dahak yang digunakan pada pemeriksaan bukanlah dahak penderita BTA.
Pada pemeriksaan BTA, sampel dahak yang diperiksa tidak ditemukan BTA dalam 100x lapangan selama 15 meni . Dapat disimpulkan sampel yang diperiksa Negatif.