Berikut ini merupakan pernyataan paling tepat tentang bakteri gram negatif adalah

Teknik pewarnaan Gram dimulai dari pengambilan spesimen, kemudian dilanjutkan dengan persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan slide di bawah mikroskop. Bakteri Gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal (20-80 nm), sehingga akan mengambil kompleks stain-mordant primer dan akan tampak biru atau ungu di bawah mikroskop. Sementara itu, bakteri Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) dan persentase ikatan silang yang rendah diikuti dengan lapisan membran luar yang tipis (7-8 nm), sehingga tidak mengikat kompleks stain-mordant dan akan tampak merah di bawah mikroskop.[1]

Persiapan Pasien

Persiapan pasien bergantung pada jenis sampel yang diambil. Beberapa jenis sampel yang dapat diambil antara lain sampel darah, biopsi jaringan, cairan serebrospinal, cairan sinovial, lavase bronkoalveolar, sputum, nanah, duh tubuh, dan urin.[2,8,9]

Peralatan

Peralatan yang perlu dipersiapkan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

• Mikroskop cahaya
• Kaca objek
• Pipet
• Api bunsen
• Kertas saring
• Inoculation loop
• Minyak imersi

Bahan-bahan yang diperlukan dalam melakukan pewarnaan Gram antara lain:

• Sampel yang akan diperiksa
• Cairan pewarna: larutan gentian violet atau kristal violet
  • Larutan A: kristal violet 2 g, etanol 95% 20 ml
  • Larutan B: ammonium oksalat 0,8 g, air steril 80 mL

• Mordant larutan iodin Gram: iodin 1 g, potassium iodida 2 g, air steril 300 ml

• Zat dekolorisasi (peluntur): etanol 95% 50 ml atau aseton 50 ml

• Counterstain:

  • Stock solution: safranin O 2,5 g, etanol 95% 100 ml

  • Working solution: stock solution 10 ml, air steril 90 mL[1]

Prosedural

Prosedur pewarnaan Gram terdiri dari persiapan apusan, pewarnaan Gram, dan pemeriksaan di bawah mikroskop.

Persiapan Apusan

Cara mempersiapkan apusan yang akan diwarnai adalah :

1. Sterilkan inoculating loop pada api bunsen hingga memerah, kemudian tunggu dingin selama sekitar 30 detik. Jika loop masih panas saat spesimen diambil, sel bakteri bisa rusak
2. Dengan menggunakan kaca objek (slide) bersih, letakkan spesimen di tengah kaca objek. Jika spesimen diambil dari agar plate, beri 1 tetes air untuk membuat suspensi terlebih dulu
3. Dengan menggunakan inoculating loop, apuskan spesimen di atas kaca objek sampai didapatkan lapisan yang tipis, kemudian keringkan di udara
4. Panaskan kaca objek dengan melewatkannya di atas api bunsen sebanyak 2-3 kali agar terfiksasi[1]

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara :

1. Tuangkan cairan pewarna kristal violet pada preparat secara merata, tunggu selama 1 menit
2. Miringkan preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
3. Tuangkan cairan mordant pada preparat, tunggu selama 1 menit
4. Miringkan kembali preparat dan bilas dengan sedikit air mengalir
5. Lakukan dekolorisasi dengan cara meneteskan cairan dekolorisasi sedikit demi sedikit pada preparat hingga tidak ada zat warna yang mengalir keluar dari preparat
6. Bilas preparat dengan air mengalir
7. Tuangkan counterstain (safranin) pada preparat, tunggu selama 30 detik sampai 1 menit
8. Bilas preparat dengan air mengalir, kemudian keringkan preparat
9. Lakukan pengamatan preparat menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 kali, 400 kali, hingga 1000 kali[4,10]

Kesalahan dalam Prosedur Pewarnaan Gram

Terdapat beberapa kesalahan yang dapat terjadi saat melakukan prosedur pewarnaan gram, antara lain:

• Pemanasan berlebihan saat fiksasi
• Preparat terlalu tebal
• Larutan kristal violet konsentrasi rendah
• Pencucian berlebihan dengan air (sebaiknya tidak lebih dari 5 detik)
• Iodin yang kurang. Semakin rendah konsentrasi iodin yang digunakan, semakin mudah dekolorisasi terjadi
• Dekolorisasi yang terlalu lama dengan etanol

• Counterstaining terlalu banyak dan terlalu lama[2]

Interpretasi

Pada akhir prosedur pewarnaan gram, dilakukan interpretasi dari preparat. Bakteri Gram positif akan berwarna biru atau ungu, contohnya Staphylococcus sp dan Streptococcus sp. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah muda, contohnya E.coli dan Salmonella typhi. Fungi seperti Candida dan Cryptococcus dapat juga diperoleh pada pemeriksaan Gram.[4]

Beberapa jenis bakteri memiliki sifat Gram variabel, di mana dapat terlihat campuran sel berwarna ungu dan merah muda. Genus bakteri Actinomyces, Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan Propionibacterium memiliki dinding sel yang rentan mengalami kerusakan saat pembelahan sel, sehingga dapat memiliki tampilan Gram negatif. Bakteri Bacillus, Butyrivibrio, dan Clostridium memiliki penurunan ketebalan peptidoglikan dalam perkembangannya, sehingga beberapa sel akan terlihat Gram negatif.[10] Gardnella memiliki dinding sel Gram positif yang berbeda, sehingga menyebabkan hasil pewarnaan menjadi Gram negatif atau Gram variabel.[4]

Follow up

Setelah prosedur selesai dilakukan, hasil dilaporkan berdasarkan standard operating procedures (SOP) laboratorium setempat. Hasil yang signifikan kemudian dapat dilaporkan pada ahli patologi atau dokter penanggung jawab pasien. Hasil pewarnaan Gram dapat membantu dokter menentukan diagnosis awal dan pemilihan antibiotik, sambil menunggu hasil kultur dan sensitivitas antibiotik.[2]

1. Moyes RB, Reynolds J, Breakwell DP. Differential Staining of Bacteria: Gram Stain. Current Protocols in Microbiology, 2009. doi:10.1002/9780471729259.mca03cs15 2. Thairu Y, Nasir IA, Usman Y. Laboratory perspective of gram staining and its significance in investigations of infectious diseases. Sub-Saharan Afr J Med 2014;1:168-74 4. Smith AC, Hussey MA. Gram Stain Protocols. American Society for Microbiology, 2005. https://www.asm.org/getattachment/5c95a063-326b-4b2f-98ce-001de9a5ece3/gram-stain-protocol-2886.pdf 8. O’Horo JC, Thompson D, Safdar N. Is the Gram Stain Useful in the Microbiologic Diagnosis of VAP? A Meta-analysis. Clin Infect Dis. 2012 Aug 15;55(4):551–61. 9. Kaftandzieva A, Cekovska Z, Kaftandziev I, Petrovska M, Panovski N. Bacteriology of Wound - Clinical Utility of Gram Stain Microscopy and the Correlation with Culture. Macedonian Journal of Medical Sciences. 2012 Mar 1;5(1):72–7.

10. Jain A, Jain R, Jain S. Staining Methods – Simple Staining, Negative Staining, Gram’s Staining and Acid-Fast Staining. In: Jain A, Jain R, Jain S, editors. Basic Techniques in Biochemistry, Microbiology and Molecular Biology: Principles and Techniques. New York, NY: Springer US; 2020. p. 111–6. (Springer Protocols Handbooks). Available from: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9861-6_31